تقدير نشاط الأميلاز بطريقة Wolgmuth

الكفاءة المستهدفة:
يقدر نشاط الإنزيم بتقدير اختفاء المادة المتفاعلة
تعريف وحدة ولقموث:
هي اكبر تخفيف لـ 1mL من اللعاب أو مصل الدم القادر على تفكيك 1mg من مطبوخ النشاء
(لا يتفاعل مع كاشف اليود اليودي ) في مدة 30mn في درجة C°37 و pH = 6.8
المبدأ:
وجود إنزيم الاميلاز مع محلول مطبوخ النشاء يعمل بفعالية متخصصة في تفكيك جزئيات النشاء مائيا إلى سكريات مركبة ثم أحادية.
وفي وجود الملون الخاص للنشاء وهو محلول اليود اليودي ( الليقول ) يمكننا تتبع تحلل مطبوخ النشاء بفعل اميلاز اللعاب ومن ثم يمكن تقدير نشاط هذا الإنزيم.







الوسائل والمواد: المواد الأدوات
- النشاء - حمام مائي
- محلول اليود اليودي - أنابيب اختبار( أنابيب الانحلال )
- ماء مقطر - ماصات
- اللعاب - دورق سعته 1L
- محلول منظم أو محلول فسيولوجي 9 g/L NaCl

طريقة العمل:
أ) تحضير مطبوخ النشاء:
- نزن 1g مسحوق النشاء النقي
- نذيبها في mL10 ماء مقطر بارد في دورق سعته 1L
- نكمل الحجم بالماء المقطر إلى mL1000
- نتركه يغلي لمدة mn30 ثم نبرده.

ب) تحضير العينة : ( التخفيفات المتسلسلة لإنزيم اميلاز اللعاب )
- نرقم 10أنابيب من 1 إلى 10.
- نضع في كل أنبوب 1mL من المحلول المنظم ( أو9g/L NaCl )
- نضيف للأنبوب الأول 1mL اميلاز اللعاب المحضر سابقا ( جمع 1mL من اللعاب ثم تمديده ) ونمزج جيدا.
- نأخذ 1mL من الأنبوب الأول و نضيفه للأنبوب الثاني و نمزج جيدا.
- نأخذ 1mL من الأنبوب الثاني و نضيفه للأنبوب الثالث و نمزج جيدا و هكذا حتى الأنبوب العاشر والأخير بعد المزج نطرح منه 1mL فنحصل على تخفيفات متسلسلة لإنزيم الاميلاز
( كما هي و الأخير أسفل الرسم التخطيطي )
- نضع الأنابيب العشرة في حمام مائي (37C°) لبعض دقائق.
- نضيف 1mL مطبوخ النشاء المحضر سابقا ( g/L1 ) للأنابيب العشرة
- نعيد الأنابيب إلى الحمام المائي (37C°) لمدّة 30mn



النتائج:

- عند إخراج الأنابيب من الحمام المائي أضف مباشرة لكل أنبوب قطرة من كاشف اليود اليودي
- سجل آخر أنبوب الذي لم يظهر به اللون الأزرق البنفسجي (التفاعل السلبي) و هذا ابتداء من الأنبوب العاشر
كما هو مبين في المثال الآتي:

رقم الأنبوب 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
التخفيفات المتسلسلة (1mL من اللعاب الممدد) 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024
التفاعل مع محلول كاشف اليود اليودي ( ليقول ) - - - - - + + + + +

إشارة + تعني تفاعل ايجابي مع كاشف اليود اليودي ( لون ازرق بنفسجي )
إشارة - تعني تفاعل سلبي مع كاشف اليود اليودي ( لون اصفر لماء اليود )

إذن اكبر تخفيف لواحد ml من اللعاب (الحاوي عـلى الاميلاز) الذي أدى إلى تفكيك 1mg من مطبوخ النشاء
في مدة 30mn في درجة C°37 و pH=6.8 هو 32/1 و عليه يقدر نشاط الاميلاز بـ:32 وحدة ولقموث
(Wolgmuth)

الأسئلة:
1. عند إعادة التجربة ظهر اللون الأزرق في الأنبوب رقم 5 ، استنتج تركيز الانزيم في هذه الحالة؟
2. ما هي العوامل المؤثرة على نشاط الأميلاز؟




النهاية

مشكورة اختي بارك الله فيك
و جزاك الله كل خير
و في ميزان حسناتك

مشكور